Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
2.6.17. ИСПЫТАНИЕ НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУНОГЛОБУЛИНА
Для определения антикомплементарной активности (АКА) иммуноглобулина определенное количество испытуемого материала (10 мг иммуноглобулина) подвергают инкубации с определенным количеством комплемента морских свинок (20 СН50), после чего титруют остаток комплемента; антикомплементарная активность выражается как поглощение комплемента, в процентах к контрольному образцу комплемента, принимаемому за 100%.
За гемолитическую единицу активности комплемента (СН50) принимают такое его количество, которое в данных реакционных условиях приводит к лизису
2,5х108 из общего количества 5х108 оптимальным образом сенсибилизированных эритроцитов.
Основной раствор магния и кальция. 1,103 г хлорида кальция R и 5,083 г хлорида магния R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворителем.
Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г хлорида натрия R и 25,48 г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного раствора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 40С в стеклянных контейнерах.
Раствор желатина. 12,5 г желатина растворяют приблизительно в 800 мл воды R и нагревают на водяной бане до кипения. Охлаждают до 200С и разбавляют до 10 л водой R. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 40С. Использованию подлежат только прозрачные растворы.
Раствор цитрата. 8,0 г цитрата натрия R, 4,2 г хлорида натрия R и 20,5 г глюкозы R растворяют в 750 мл воды R. Доводят значение рН до 6,1 раствором лимонной кислоты R концентрацией 100 г/л и разбавляют водой R до 1000 мл.
Буферный раствор желатина и барбитала. 4 объема раствора желатина добавляют к 1 объему основного буферного раствора барбитала и перемешивают. При необходимости доводят значение рН до 7,3, используя 1 М раствор гидроксида натрия или 1 М хлористоводородную кислоту. Хранят при 40С. Ежедневно готовят свежие растворы.
Стабилизированная овечья кровь. Смешивают равные объемы овечьей крови и раствора цитрата и перемешивают. Хранят при 40С не менее 7 и не более 28 дней. (Стабилизированная овечья кровь и эритроциты овцы доступны в различных коммерческих источниках).
Гемолизин. Антисыворотку против красных кровяных телец овцы готовят с использованием кроликов. (Такие антисыворотки доступны в различных коммерческих источниках).
Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугированием при температуре около 40С. Сыворотку хранят в небольших количествах при температуре ниже -700.
МЕТОД
Приготовление стандартизированной 5% суспензии эритроцитов овцы. Эритроциты овцы отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной овечьей крови, промывают не менее трех раз буферным раствором желатина и барбитала и готовят в том же растворе суспензию с содержанием клеток 5 объемных процентов. Плотность клеток в суспензии определяют следующим образом: 0,2 мл добавляют к 2,8 мл воды R и центрифугируют лизи-рованный раствор 5 минут при 1000 g; плотность клеток соответствует требованиям, если оптическая плотность (2.2.25) супернатанта при 541 нм составляет
0,62+0,01. Плотность клеток корректируют добавлением буферного раствора желатина и барбитала в соответствии с формулой:
V ¦ A Vf = V—A,
0,62
где :
Vf - окончательный объем после коррекции,
Vi - исходный объем,
А - оптическая плотность исходной суспензии при 541 нм.
Суспензия после коррекции содержит около 1х109 клеток в миллилитре.
Титрование гемолизина
Готовят разведения гемолизина в соответствии с Таблицей 2.6.17.-1.
Таблица 2.6.17.-1
Требуемое разве Готовят с использованием
дение гемолизина
Буферный раствор желатина и бар Гемолизин
битала
Объем Разведение (1 : ...) Объем(мл)
(мл)
7,5 0,65 неразбавленный 0,1
10 0,90 неразбавленный 0,1
75 1,80 7,5 0,2
100 1,80 10 0,2
150 1,00 75 1,0
200 1,00 100 1,0
300 1,00 150 1,0
400 1,00 200 1,0
600 1,00 300 1,0
800 1,00 400 1,0
1200 1,00 600 1,0
1600 1,00 800 1,0
2400 1,00 1200 1,0
3200* 1,00 1600 1,0
4800* 1,00 2400 1,0
*1,0 мл смеси отбрасывают
К каждой пробирке из серии разведении гемолизина, начиная с разведения 1:75, добавляют по 1,0 мл 5% суспензии эритроцитов овцы и перемешивают. Инкубируют при 370С в течение 30 минут.
